Принцип метода. Использование флуорексона для комплексоно-метрического определения кальция основано на том, что его водные растворы в силыющелочной среде не флуоресцируют, по в этих же условиях флуорексон образует с кальцием флуоресцирующие комплексы. Комплекс индикатора с металлом менее прочен, чем комплекс металла с трилоном Б, поэтому по мере добавления последнего к раствору, содержащему металл и индикатор, происходит постоянный переход ионов металла к три-лону Б. При титровании трилоном Б в точке эквивалентности отмечается резкое «затухание» флуоресценции.
Реактивы:
1) 0,1 н. раствор трилона Б (комплексен III, ЭДТА). Готовят из стандарт-титра; 2) 0,005 н. раствор трилона Б. Готовят из ОД н. раствора. 10 мл 0,1 н. раствора в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 200 мл. Устойчив в течение 2 мес;
3) индикаторная смесь: индикатор флуорексон (чда) и калий хлористый (чда, хч) в соотношении 1 : 100;
4) 1 моль/л раствора калия гидроокиси (едкий кали) (чда, хч). Допускается примесь кальция не более 1 мг%;
5) стандартный, 100 мг% раствор кальция. 2,497 г кальция углекислого (хч), высушенного до постоянной массы при 100- 120 °С, вносят в мерную колбу, на 1 л добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты и после растворения соли доводят бидистиллированной водой до метки; 1 мл раствора содержит 1 мг кальция;
6) рабочий 10 мг% раствор кальция. Готовят разведением 100 мг% раствора кальция дистиллированной водой 1:10 (1 мл 100 мг% раствора кальция и 9 мл воды). Рабочий раствор кальция необходим для установления «затухания» флуоресценции при титрации и контрольной проверки метода.
Оборудование. Микробюретки емкостью на 2 мл с градуировкой на 0,01 мл, оканчивающиеся вытянутым капилляром с оттянутым концом, что дает возможность проводить титрование меньшими каплями. Пипетки емкостью на 1 и 10 мл. Стаканчики для титрации.
Посуду перед использованием выдерживают в разведочных растворах трилона Б и многократно промывают бидистиллированной водой.
Ход определения. В стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 5 мл раствора калия гидроокиси и несколько кристалликов индикаторной смеси. Появляется флуоресценция, обусловленная присутствием в приготовленной смеси кальция.
Для связывания кальция в смесь из микробюретки добавляют по каплям раствор трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания. Обычно для этою требуется 1 капля раствора трилона Б. Большое количество свидетельствует о высокой концентрации кальция в растворе калия гидроокиси и его непригодности для анализа. Примесь кальция в растворе может быть обусловлена некачественной подготовкой посуды или неисправностью дистиллятора.
После связывания кальция, находящегося в растворе натрия гидроокиси, в этот же стаканчик добавляют 0,5 мл сыворотки крови и снова оттитровывают раствором трилона Б до исчезновения флуоресценции и появления бледно-розового окрашивания. Расчет ведут по формуле (мг%):
Са=а*20
где а - количество раствора трилона Б, пошедшее на титрование сыворотки крови, мл; 20 - коэффициент для пересчета в мг % при условии, что титр 0,005 н раствора трилона Б равен 1.
Клиническое значение. Кальций - преимущественно внеклеточный элемент. Около 99% его находится в составе костной ткани, остальное количество во внеклеточной жидкости, главным образом в плазме крови.
Кальций является одним из важнейших компонентов системы, регулирующей проницаемость мембран. Ионы кальция способствуют взаимодействию актина и миозина, т. е. сокращению мышечных волокон. Этот эффект осуществляется с участием магния и АТФ. В нервно-мышечных синапсах ионы кальция способствуют выделению ацетилхолина и связыванию его с холи-норецепторами, а при избытке ацетилхолина активизируют хо-линэстеразу, расщепляющую ацетилхолин.
Под общим кальцием понимают кальций, связанный с белками сыворотки крови (главным образом с альбуминами) и кислотами, а также ионизированный кальций.
Уровень кальция в крови здоровых животных указан в таблице 1. Он зависит от содержания кальция, фосфора и витамина D в рационе, состояния гормональной системы, желудочно-кишечного тракта, почек, печени и других органов.
Понижение уровня кальция в крови отмечают при длительном недостаточном поступлении его с кормом, плохом усвоении вследствие дефицита витамина D и паратгормона, которые обеспечивают его всасывание в кишечнике и препятствуют выведению с мочой. Гипокальциемия сопровождает алиментарную остеодистрофию, рахит, вторичную остеодистрофию и многие другие болезни. Уровень кальция в крови стабильно удерживается длительное время за счет мобилизации его из костной ткани. Компенсаторные механизмы проявляются при развитии алиментарной остеодистрофии и рахита, при которых низкий уровень кальция в крови обнаруживают при затяжном, тяжелом течении патологического процесса.
Резко выраженную гипокальциемию наблюдают при послеродовом парезе. Причиной гипокальциемии могут быть нефроз и нефрит, когда наступает гипопротеинемия, а следовательно, потеря связанного с белком кальция.
Повышение уровня кальция в крови может быть при передозировке витамина D, гиперфункции паращитовидных желез.