Принцип. Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью; при этом образуются соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.
Реактивы. 1. 0,9%-ный раствор натрия хлорида.
2. 0,2 н. (0,2 моль/л) раствор едкого натра, свободный от углекислого газа. 8 т вещества вносят в мерную колбу на 1 л и приливают до метки кипяченой дистиллированной водой или готовят из 1 н. (моль/л) раствора едкого натра: 20 мл 1 н. раствора NаОН доводят до 100 мл кипяченой дистиллированной водой.
3. Биуретовый реактив основной. 4,5 г сегнетовой соли (КNаС4Н4О6) растворяют в мерной колбе на 100 мл в 40 мл 0,2 н. раствора едкого натра. После рас- творения прибавляют 1,5 г меди сульфата (СuSО4*5Н2О) и 0,5 т калия йодида (KI). Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл 0,2 н. раствором едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек. 4. 0,5%-ный раствор калия йодида в 0,2 н. растворе едкого натра. 2,5 г калия йодида вносят в мерную колбу на 500 мл и доливают до метки 0,2 н. раствором едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла не более 2 нед.
5. Рабочий раствор биуретового реактива. Смешивают одну часть основного биуретового раствора (3) с четырьмя частями 0,5%-ного раствора калия йодида (4) . Хранят в холодильнике в темной посуде не более 2 нед.
6. Стандартный раствор альбумина, основной. В пробирку вносят 1 г кристаллического сывороточного (из человеческой или бычьей сыворотки) альбумина и 9 мл 0,9%-ного раствора хлорпстого натрия. Тщательно перемешивают. 1 мл раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике. Сывороточный альбумин должен отвечать требованиям стандарта.
Оборудование. Фотоэлектроколориметр; колбы мерные.
Ход определения. К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива, смешивают, избегая образования лены. Через 30 мин (но не позже чем 1 ч) измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540—560 нм (зеленый светофильтр) против контроля (5 мл рабочего раствора биуретового реактива и 0,1 мл 0,9 % -ного раствора натрия хлорида). Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого готовят рабочие стандартные растворы из основного стандартного раствора 10%-ного белка.
5. Приготовление рабочих стандартных растворов белка
Из каждого (из 4) разведенья в 5 пробирок вносят по 0,01 мл раствора альбумина и обрабатывают, как и сыворотку крови. Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с раствора наименьшей концентрации. По полученным средним данным из 5 определений строят калибровочную кривую. Калибровочную кривую проверяют периодически.
П р и м е ч а н и я. 1. Содержание белка в стандартном растворе должно быть не менее 7%. 2. При содержании белка в сыворотке больше 10% последнюю разводят физиологвческим раствором 1:1, результат ум- ножают на два. Ошибка метода 2%.
Источник: Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание/И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов и дрр. –М: Агропромиздат, 1985.-287с.